Микологический анализ

Первичные посевы. Для первичного выделения грибов из мучнистых, зерновых кормов используют обычно агаровую среду Чапека, а для выделе­ния грибов из грубых кормов — влажные камеры. Для дифференциации видов и разновидностей грибов в каждом отдельном случае применяют спе­циальные методы и приемы культивирования.

Заражение зерна грибами может быть поверхностным (заспорение) и глубинным (поражение). Для выявления глубинного поражения проводят дезинфекцию зерна 3%-м раствором формалина (за основу берут 40%-й формальдегид) или водным раствором сулемы (1 : 1000). Зерна (50 штук), завернутые в марлевую салфетку, помещают в стаканчик с дезинфицирую­щим раствором. Через 1-2 мин их переносят в стаканчик со стерильной водой, к которой для нейтрализации формалина добавляют 2-3 капли 5% -го раствора аммиака. Затем воду сливают и стерильным пинцетом переносят зерна на питательную среду (агар Чапека) так, чтобы они не соприкасались. Мелкие зерна (пшеница, овес, ячмень, рожь, просо и др.) раскладывают по 10 штук на чашке, крупные (кукуруза, бобы, горох) — по 5. Крупные зерна рекомендуется после дезинфекции разрезать пополам или расщепить. Число чашек при посеве мелких зерен должно быть не менее 5, а при посеве крупных — не менее 10.

Выявление поверхностной микрофлоры, необходимое для контроля зерна на зараженность патогенным грибом, проводят путем раскладывания зерен по поверхности среды без предварительной поверхностной дезинфекции. Число посеянных зерен должно быть не менее 20. Если имеется подозрение на пора­жение зерна грибами целлюлозоразрушителями (Dendrodochium toxicum, Stachybotrys alternans и др. Л их сеют дополнительно во влажные камеры со средой Ван-Итерсона (или стерильной водой).

Для выделения грибов Dendrodochium toxicum, Stachybotrys alternans из грубых кормов применяют влажные камеры. На дно чашки Петри кладут тонкий слой ваты и на нее помещают кружок фильтровальной бумаги (по диаметру чашки), затем чашки стерилизуют и перед посевом фильтроваль­ную бумагу увлажняют небольшим количеством стерильной среды Ван-Итер­сона (или стерильной воды). Солому, сено нарезают кусочками длиной по 2 см и переносят стерильным пинцетом в три чашки Петри с агаризированной средой, раскладывают их по 10 кусочков в каждую чашку, а в три влажные камеры помещают не менее 90 кусочков из той же пробы (по 30 кусочков в каждую чашку). Для выделения гриба Dendrodochium toxicum, развивающегося внутри стебля растения, стебель предварительно расщепля­ют или разрезают вдоль.

Нарезанный силос и измельченный жмых для выделения грибов раскла­дывают по 10 кусочков на поверхности агара Чапека.

Для выделения грибов из муки, отрубей, комбикорма, шротов, мясокост­ной муки пользуются методом разливки. Для этого образец гранулирован­ного или брикетированного корма предварительно размалывают на лабора­торной мельнице. Корм (10 г) помещают в колбу со 100 мл стерильного 0,1%-го раствора поверхностно-активного вещества (ОП-7, ОП-10, твин-80) в дистиллированной воде. Затем пробу встряхивают на шюттель-аппарате в течение 15-20 мин. Из полученной взвеси № 1 (1 : 10) готовят последующие разведения, используя также стерильные растворы вышеназванных поверх­ностно-активных веществ (ПАВ), следующим образом: 1 мл взвеси перено­сят стерильной градуированной пипеткой (конец пинетки следует обрезать для свободного прохождения частиц комбикорма, после чего пипетка долж яа быть откалибрована на 1 мл) в пробирку с 9 мл раствора ПАВ и получают взвесь №2 (1: 100). Из полученной взвеси № 2 готовят аналогичным обра­зом взвесь № 3 (1 : 1000) и, если необходимо, взвесь № 4 (1 : 10000). Перед взятием очередной порции взвеси, как для получения дальнейшего разведе­ния, так и для посева, необходимо тщательно перемешивать взвесь пипет­кой, а также промывать пипетку во взвеси не менее 5 раз. Корм с нормаль­ными органолептическими показателями разбавляют 1 : 1000, подвергав­шийся порче — 1 : 10000.

Посев проводят сразу после приготовления последней взвеси (№ 3 или № 4), не давая ей отстояться. При этом 1 мл взвеси равномерно распределя­ют по всей поверхности питательной среды.

Число чашек, необходимых для посева, зависит от разведения: при раз­ведении 1 : 1000 требуется 5 чашек, при разведении 1 : 10000 — 8.

Культивирование посевов. Чашки Петри с посевами завертывают в сте­рильную бумагу, помещают в термостат и выдерживают при температуре 22-25°С в течение 7-10 суток. Рост и спороношение грибов становятся заметны­ми уже через 3 суток. Однако для идентификации грибов необходимо боль­шее время культивирования — 5-7 суток. Для выявления гриба Asp. fumigatus в комбикормах пробу (10 г) взвешивают с точностью до 0,01 г и тщательно перемешивают. Корм высевают в разведении 1 : 1000.

Выявление Asp. fumigatus в зерне проводят путем посева зерен без пред­варительной дезинфекции, однако для количественного учета гриба необхо­димо предварительно измельчить зерна и провести их посев способами, из­ложенными выше.

Показателем степени засоренности корма грибом служит число диаспор (грибных зародышей) в 1 г исследуемого корма, которое определяют после подсчета выросших колоний с учетом количества посеянного материала и степени разведения.

Количественный учет грибов. В мучнистых кормах подсчет колоний после посева начинают на 2-3 сутки. Для облегчения подсчета дно чашки размечают карандашом на секторы или используют счетную камеру Воль-фюгеля.

Проводят 2-3 последовательных подсчета. Общее число колоний данного вида гриба определяют в пересчете на 1 г исследуемого корма.

Пример расчета. 50 зерен пшеницы посеяно в 5 чашках с агаром. Во всех 5 чашках выросло 3 колонии Fusarium sporotr., что составляет 6% числа посеянных зерен.

Более точный учет грибов в зернофураже (а также в грубых кормах) можно провести, предварительно измельчив корм и посеяв так же, как мучнистые корма.

Выделение чистых культур грибов из первичных посевов. Родовую, а в ряде случаев и видовую принадлежность грибов устанавливают в первичном посеве, однако часто вид гриба определяют после выделения его в чистую культуру. Для этого применяют два метода: метод непосредственного пересева и метод разделения. Получение чистых культур необходимо для даль­нейшего изучения их токсигенности.

Метод непосредственного пересева — иглой, загнутой под тупым углом, осторожно захватывают кусочек мицелия и помещают его на поверхность питательной среды. При этом следует избегать комкания, скручивания или прочих деформаций подхваченного кусочка мицелия. В случае обильного спороношения у гриба сухой иглой переносят минимальное количество спор (метод сухой иглы). При работе с грибами нельзя производить посевы штри­хом, а тем более зигзагообразным штрихом. Допускается только легкое касание в одном месте поверхности среды (если посев проводится в пробир­ку, то посередине ее) иглой, несущей споры или мицелий.

Метод непосредственного пересева возможен только тогда, когда в чашке с первичными посевами имеются достаточно чистые колонии или когда необходимо возобновить чистую культуру с целью длительного поддержива­ния культуры гриба.

Метод разделения применяют в двух случаях.

1. Если колонии загрязнены другими грибами или бактериями. Это устанавливают обычно визуально, готовя 3-4 последовательных разведения взвеси спор гриба в стерильном 0,1%-м растворе твина-80 в воде, и высевают из одного-двух последних разведений по 1 мл на поверхность агара в чашки Петри, распределяя взвесь шпателем или наклоняя чашку в разные стороны.

2. При наличии обильного спороношения. Разделение проводят с помощью посева — коснувшись стерильной влажной иглой (или крючком) ограниченного участка спороносящей поверхности, проводят штрихом по поверхности агаровой пластинки в чашке Петри. Культивируют посевы при 22-25°С. Сроки культивирования в зависимости от рода и вида гриба различны — до образования характерного спороношення.

По истечении срока культивирования гриба проводят макроскопическое изучение колоний. При этом обращают внимание на их цвет и форму, харак­тер роста (распростертые или компактные), растущий край колонии (глад­кий или извилистый), окраску субстратного мицелия, на наличие или отсут­ствие пигмента, выделенного в субстрат, цвет пигмента, на степень развития воздушного мицелия, наличие или отсутствие склероцитов.

Микроскопическое исследование грибов проводят, прежде всего, непос­редственно в чашках, пользуясь только малым увеличением микроскопа (МБС-1, МБС-2). При этом выявляют наличие мицелиальных тяжей склеро­цитов плодовитых тел, строение и характер ветвления спорангиеносцев или конидиеносцев, форму спорангия мукоровых грибов или головки аспергиллов, расположение конидий (цепочками или одиночно) и т. д.

Затем готовят препараты для детального изучения морфологии гриба. Частицы гриба в зависимости от вида берут из различных мест колонии: в старых частях колонии из центра, в более молодых — по краям.

На предметное стекло наносят каплю фиксирующей жидкости. Затем иглой осторожно берут небольшое количество мицелия гриба, стараясь не повредить его, и вносят в каплю жидкости, аккуратно снимая его другой иглой. Препарат накрывают покровным стеклом, оттянув избыток жидко­сти кусочком фильтровальной бумаги.

Фиксирующей жидкостью, наиболее пригодной для приготовления пре­паратов грибов из рода Aspergillus, Penicillium и ряда других, служит лакто-фенол Аммана (дистиллированная вода — 1 часть, молочная кислота — 1 часть, глицерин — 2 части, фенол — 1 часть). Прежде чем поместить ма­териал в эту жидкость, его следует кратковременно обработать 70%-м этило­вым спиртом.

Для изучения грибов из рода Fusarium и некоторых других используют жидкость, состоящую из равных частей дистиллированной воды, этилового спирта и глицерина. При этом исследуемый материал не обрабатывают 70% -м этиловым спиртом. Для улучшения видимости контуров конидий и перего­родок в них к 100 мл указанной жидкости добавляют 0,5-1 мл 0,01%-го водного или спиртового раствора метилового синего.

Оба вышеназванных фиксатора позволяют хранить препарат в течение долгого времени. С помощью малого (х8, х10), а затем большого (х40, х90) увеличения микроскопа изучают препараты и, пользуясь специальными оп­ределителями с микроскопическими ключами, идентифицируют грибы.

Определение токсичности культур грибов, выделенных из образцов кор­мов, необходимо проводить:

- если скармливание подозрительного по качеству корма вызвало заболе­вание или гибель подопытных животных;

- при положительной кожной пробе с воспалительной реакцией на коже

кролика II, III степени;

- для установления роли выделенного из корма гриба в этиологии заболе­вания.

Токсичность культур грибов определяют: на парамециях, кожной пробой на кролике, введением различными способами культур грибов мышам и др.

Определение токсичности культур грибов на парамециях (Paramecium caudatum). Метод применяют для первичного установления токсичности культур как известных (Fusarium, Stachybotrys alternans, Bendrodochium, Aspergillus и др.), так и выделенных из кормов неизвестных грибов.

Из культуры гриба на агаризованных средах (на среде Чапека, сусловом агаре и др.) готовят водные экстракты. Для этого пленки грибов снимают с поверхности агара, освобождают от него, измельчают, помещают в пробирку и заливают дистиллированной или стерильной водопроводной водой в соот­ношении 1:1, встряхивают и оставляют при температуре 4-10°С на 24 ч.

Среды для культивирования парамеций (Paramecium caudatum).

Сенной настой. Нарезанное кусочками сено (без цветов) или солому помещают в колбу, заливают водопроводной водой в соотношений 1 : 2 по объему, закрывают ватной пробкой и кипятят в течение 20 мин. Затем кол­бу помещают в термостат 37°С на 3 суток для накопления в среде сенной палочки (Вас. subtilis), которая служит кормом для парамеций. После этого в полученную среду помещают каплю с парамециями.

Культивируют парамеции при комнатной температуре, периодически (1 раз в месяц) пересевая их в новую среду.

Молочная среда. Кипяченую воду оставляют на одни сутки для насыщения кислородом: на каждые 15-20 мл добавляют 2-3 капли сырого снятого молока. Для накопления молочнокислых бактерий, которыми пита­ются парамеции, пробирки или колбы с молочной средой помещают на 3 суток в термостат (37°С), после чего в готовую среду помещают парамеции; 3-4 раза в месяц в среду добавляют молоко.

Примечания: 1) культуру с парамециями необходимо постоянно кон­тролировать для предупреждения загрязнения ее другими простейшими; 2) посуда, в которой культивируют парамеции, а также предметные стекла и пипетки должны быть химически чистыми; 3) вода, используемая для приготовления экстрактов, должна иметь нейтральную реакцию и не содер­жать посторонних примесей. Нельзя применять физиологический раствор, так как парамеции чувствительны к соли.

Метод применяют для ориентировочного определения токсичности гри­бов, в первую очередь таких, как Stachybotrys alternant Dendrodochium, виды рода Fusarium, он дает возможность выявлять водорастворимые токси­ческие вещества.

Две капли экстракта из культуры гриба наносят на предметное или часовое стекло и добавляют одну каплю среды с парамециями. Все 3 капли должны быть одинаковыми по объему, поэтому их наносят градуированной пипеткой.

Предметное или часовое стекло помещают в чашки Петри с фильтроваль­ной бумагой, смоченной водой.

Критерием для определения чувствительности служит время от начала воздействия испытуемого экстракта до гибели парамеций. Гибель параме­ции определяют по прекращению их движения и наличию распада.

Для быстрого определения токсичности грибов, таких как Stachybotrys alternans, Fusarium sporotrichiella, Dendrodochium, берут кусочек колонии гриба, выросшего в чашке Петри при первичном посеве корма, переносят на предметное стекло, шпателем или петлей измельчают, заливают нескольки­ми каплями дистиллированной воды и смешивают. Через два часа пленку гриба удаляют или отодвигают в сторону и вносят каплю среды с простейши­ми и ведут наблюдение. Многие метаболиты с острой токсичностью вызыва­ют гибель простейших в период от 1 до 20-30 мин; со слабой — до 1-2 ч, иногда несколько дольше.

Определение токсичности культур грибов методом кожной пробы на кролике. В матрицы емкостью 1,5 л или конические колбы на 1000 мл поме­щают 200 г раздробленного зерна (кукуруза, рис, ячмень, пшеница и др.) или 30-50 г грубого корма, увлажняют водой (к зерну добавляют 100 мл для культивирования Aspergillus и Fusarium и 200 мл для Penicillium; к грубому корму — 20 мл) и стерилизуют в автоклаве при давлении 1 кгс/см² течение 30 мин. Приготовленную среду засевают суспензией спор испытуемого гриба, предварительно выделенного в чистую культуру из первичного посева. Сус­пензию получают путем добавления в пробирку с культурой 3-5 мл физиоло­гического раствора, содержащего 0,1% твина-80, ОП-7 пли ОП-10, и встря­хивая ее для определения спор. Колбы с посевами тщательно встряхивают.

Культивируют грибы при температуре 25-27°С в течение 10 дней. Для накопления митотоксинов грибами из рода Fusarium (Т-2 токсин, Ф-2 токсин) культуры дополнительно выдерживают при пониженной температуре (5-7) 15-30 суток.

Накопление токсических веществ в среде идет параллельно с ростом и развитием грибов. По окончании сроков культивирования культуру извле­кают из сосудов, помещают в пакеты из фильтровальной бумаги и подсуши­вают при температуре 40-45°С, после чего измельчают. Кожную пробу на кролике ставят и учитывают так же, как при определении токсичности кормов.

Можно применять упрощенный способ определения токсичности чистых культур грибов методом кожной пробы на кролике. Для этого снимают мицелиальную пленку гриба, выросшего на питательной среде, растирают до кашицеобразного состояния и стеклянной палочкой или шпателем нано­сят на кожу кролика.

Работу с культурами грибов проводят с соблюдением режима микробио­логической лаборатории и мер индивидуальной безопасности.