logo
селекция растений

5.2.2. Физические методы получения мутантов

Среди физических мутагенов чаще всего используют излучения различного типа. Они бывают двух видов: ионизирующие и неионизирующие.

Ионизирующие излучения. Рентгеновское, гамма- и нейтронное излучения называются ионизирующими за способности превращать атомы и молекулы в электрически заряженные частицы — ионы,' т.е. вызывать ионизацию.

Рентгеновское излучение начали применять первым в мутагене­зе, его используют широко и в настоящее время, поскольку рентге­новские аппараты имеются во многих учреждениях, ими просто управлять, рентгеновским излучением относительно легко воздей­ствовать как на семена, так и на другие части растений, несложно менять дозы облучения.

Источником гамма-излучения обычно служит радиоактивный кобальт (60Со) или цезий (l37Cs). На объект воздействуют двумя спо­собами обработки: острым (мощное кратковременное излучение) и хроническим (длительное, но значительно более слабое).

Нейтронное излучение возникает в результате ядерных реакций. В частности, при делении ядер урана и плутония. Различают быст­рые нейтроны (энергия ионообразования 0,2-26 МэВ) и медлен­ные, или тепловые (энергия 0,0025 эВ). Быстрые нейтроны оказы­вают мутагенное воздействие преимущественно в момент облуче­ния, тепловые — вызывают наведенную радиоактивность в самой клетке. Относительная биологическая эффективность нейтронов в 10-40 раз выше, чем гамма- и рентгеновского излучения.

Радиоактивные изотопы. В качестве мутагенных факторов мож­но применять также радиоактивные изотопы фосфора (32Р) и серы (35S), у которых период полураспада составляет соответственно 14,3 и 87,1 дня. Частота появления мутации зависит от дозы облучения. Однако эта пропорциональная зависимость наблюдается только в интервале 100%-ной выживаемости. С переходом в интервал от ЛД0 до ЛД|000 (ЛД0 — порог выживаемости, ЛД|000 — гибель всех растений) пропорциональность нарушается за счёт гибели облучаемых расте­ний. За критическую обычно принимают такую дозу, при воздей­ствии которой выживает 30-40 % растений (ЛД30 40).

Неионизирующие излучения. Генетически эффективным неионизирующим излучением считается ультрафиолетовое (УФ). Оно имеет большую длину волны (200-400 нм), чем ионизирующие излуче­ния, и меньшую энергию. При его воздействии происходит не иони­зация вещества, а только возбуждение молекул. Проникающая спо­собность УФ очень мала, его используют только для обработки пыль­цевых зерен.

Лазерное излучение также производит мутагенный эффект. Пока­зано, что при воздействии на семена и вегетирующие растения им­пульсным и непрерывным (в том числе и низко интенсивным) ла­зерным излучением видимой области спектра можно получить вы­сокий выход мутантных форм (Ю. Гужов и др., 1991).

Первые опыты по использованию рентгеновских лучей для вызы­вания мутаций у лесных древесных пород были проведены В.Н. Су­качевым на ивах в 1933 г. Облучались черенки (более 5000), семена и цветки. Им было установлено, что большие дозы облучения без­вредны для черенков и летальны для семян. При этом сильные до­зировки даже стимулировали рост побегов и черенков. По резуль­татам опытов с облучением черенков были описаны две мутации по листьям: узколистость и курчавость, обнаруженные у четырех ви­дов ивы. В эти же годы И. Никитиным установлено стимулирую­щее влияние рентгеновских лучей на всхожесть семян березы и сосны и прорастание пыльцы липы.

В 50-х годах М.А. Кудинов в Белоруссии провел большое много­летнее исследование по изучению влияния ионизирующих излуче­ний на лесные растения. В опытах изучено 49 видов лесных и деко­ративных деревьев и кустарников. Установлены стимулирующие Прорастание семян дозы и летальные. Показана очень высокая радио устойчивость семян у некоторых кустарников. Так, ракитник русский и барбарис амурский имели повышенную всхожесть семян При их облучении 60000 рад. Хвойные породы, особенно ель обык­новенная, имели низкую всхожесть уже при 100 и 200 рад.

Г.Ф. Привалов (1965, 1968, 1974) проводил облучение семян у- и рентгеновскими лучами. Им установлены критические дозы облу­чения для 30 видов древесных растений. Наиболее радиочувстви­тельными оказались семена хвойных (сосна сибирская, лиственница, сосна, ель), березы и ольхи. Для этих видов растений критичес­кие дозы (ЛД75) лежат в пределах 2-6 кР. Наиболее устойчивыми (критическая доза более 20 кР) оказались семена облепихи, гледи чии, тополя. В результате опытов не только с семенами, но и с рас­тениями получен ряд мутантных форм.

Ф.Л. Щепотьевым в Донецком ботаническом саду выведены многочисленные мутанты дуба, тополя, каштана конского, биоты восточной, шиповника, айвы японской, облепихи и других пород. Мутанты плодоносят, в результате чего получено второе поколение М2. У дуба черешчатого при обработке гамма-лучами Со60 дозами от 103 до 6-Ю3 рад выделены мутантные формы по характеру крон и особенностям роста: плакучая, пирамидальная, флаговидная, чаше­видная, стелющаяся, карликовая, кустарниковая, быстрорастущая. Рост некоторых опытных растений дуба в семилетнем возрасте пре­вышал контрольные по высоте и диаметру в 2-3 раза. У клена се­ребристого после облучения семян гамма-лучами дозами 579, 1158 и 1544 рад в 10-летнем возрасте выделены следующие формы: Донецкий ботанический — пестро-золотистая декоративная форма, пу­шистый, плакучий с поникающими ветвями и разрезно-узколопастными листьями, краснолистный. У тополя волосистоплодного в результате облучения черенков гамма-лучами дозами 50-150 рад выделен пестролистный мутант — Донецкий золотой. При облуче­нии гамма-лучами Со60 шиповника получены следующие результа­ты. Дозы облучения от 3 до 10 кР стимулировали всхожесть, а высо­кие дозы (18-21 кР) понижали ее. Выделены мутанты с различной крупностью плодов, формой листьев, повышенным содержанием аскорбиновой кислоты в плодах и масла в семенах, а также расте­ния без шипов на побегах и листьях (Ф. Л. Щепотьев, 1982).

Таким образом, работы с физическими мутагенами показали воз­можность их использования в практических целях для получения декоративных и быстрорастущих форм лесных древесных пород.

      1. Химические методы получения мутантов

Химические мутагены по их действию делят на пять классов:

Наиболее распространенными и широко используемыми в пос­ледние десятилетия в России являются алкилирующие соединения, в частности супермутагены. К ним относятся этиленимин (ЭИ), диэтилсульфат (ДЭС), диметилсульфат (ДМС), нитрозоэтилмочевина (НЭМ), нитрозометилмочевина (НММ) и др.

Чувствительность растений к мутагенам можно оценивать по энергии прорастания и всхожести семян, выживаемости растений, энергии роста, частоте и спектру хромосомных нарушений в пер­вом митозе в клетках проростков. Для получения наибольшего ко­личества полезных мутаций рекомендуется брать концентрации близкие к критическим.

Химические мутагены применяют в виде водных растворов раз­личной концентрации (обычно 0,01-0,2% в течение 18-24 ч) или в газовой фазе. Чаще воздействию подвергают различные вегетатив­ные органы — семена, черенки, почки и т. п. Недостатком этого способа воздействия являются частое возникновение химерных ра­стений, содержащих мутантные и немутантные ткани, и невысокая эффективность из-за гибели обработанного материала, особенно при средних и жестких концентрациях, что ведет к потере значи­тельного количества мутаций.

Эффективность действия мутагенов зависит от многих факто­ров, в частности: особенностей генотипа, способа воздействия, вида мутагена, его концентрации (дозы) и экспозиции, кислотности и температуры раствора, обрабатываемого органа, его физиологичес­кого состояния в момент обработки и др. Как и при физических воздействиях, при химической обработке черенки обычно более устойчивы к мутагенам, чем семена. Набухшие семена чувствитель­нее сухих. Генеративные органы чувствительнее вегетативных. По­липлоиды устойчивее диплоидов. Поэтому в каждом конкретном случае оптимальные режимы воздействия подбираются эксперимен­тальным путем. Полезные мутации возникают крайне редко, не бо­лее одной-двух на тысячу мутаций.

Индуцирование химических мутантов лесных древесных пород начало широко применяться в разных регионах с середины 60-х го-дон. В Донецком ботаническом саду Ф.Л. Щепотьевым получены декоративные и быстрорастущие формы дуба черешчатого (стелю­щиеся, плакучие, колонновидные и др.), биоты восточной (с пирамидальной, яйцевидной, шаровидной и овальной кроной) и других i к >род. В НИИ лесной генетики в Воронеже Е.М. Гуляевой, О.С. Машкиной и другими сотрудниками получены хемомутанты сосны обык­новенной и тополя бальзамического. У сосны — быстрорастущие, равноплодоносящие, треххвойные, редкохвойные и др. У тополя — быстрорастущие, пирамидальные, плакучие и др. Интересные ре­зультаты с сосной обыкновенной получены Е.Н. Самошкиным в Брянске (Ф.Л. Щепотьев, 1982; О.С. Машкина, 1995; Е.Н. Самошкин, 1986).

5.3. Экспериментальная полиплоидия лесных древесных пород

Для искусственного получения полиплоидов используют различ­ные факторы воздействия: физические (температура, ионизирую­щие излучения), химические (колхицин, хлороформ, закись азота, супермутагены и др.) и механические (декапитация). По способу по­лучения полиплоиды делятся на митотические, мейотические и зиготические (М.Е. Лобашов, 1967; Е.П. Раджабли и др., 1967; А.И. Колес­ников, 1972; О.С. Машкина, 1995).

Митотические полиплоиды возникают из соматических клеток при воздействии полиплоидогенными веществами (колхицином и др.) на вегетативные части растений (семена, точки роста, проростки и т. п.) при погружении их в раствор, помещении под капли раствора мута­гена, наложении на них ватного тампона, инъекции и т.п.

Эффективность полиплоидизации в значительной степени оп­ределяется генетическими особенностями обрабатываемого мате­риала, стадией его развития в момент обработки, способами обра­ботки, концентрацией и температурой применяемого раствора, про­должительностью воздействия. Оптимальные условия обработки устанавливают для каждого объекта опытным путем. Метод обра­ботки семян дает лучшие результаты у быстрорастущих растений — осины, тополя и др.

Недостаток этого способа — возникновение преимущественно миксоплоидных растений (т.е. особей, содержащих в различном соотношении клетки и ткани разного уровня плоидности, в част­ности диплоидных и тетраплоидных). При достаточно высоком со­держании диплоидных клеток (до 50% и выше) в таких миксоплоидах появляется опасность их деполиплоидизации, т.е. возвращения растения на исходный диплоидный уровень. Поэтому для сохране­ния полиплоидной ткани необходима дополнительная работа по расхимериванию, для чего срезают растения на пень, удаляют дип­лоидные быстрорастущие ветви, стимулируя развитие более мед­леннорастущих тетраплоидных побегов.

Мейотические полиплоиды возникают от участия в гибридизации нередуцированных диплоидных, триплоидных и даже тетраплоидных гамет. Продуцентами таких гамет могут быть полиплоидные или му тантные диплоидные растения. Возникающие при этом полиплои­ды будут устойчивыми, цитологически стабильными. Мейотические полиплоиды можно получать различными путями, в частности:

Зиготические полиплоиды получают путем полиплоидизации зи­готы в период её первого деления. Такие полиплоиды получены колхицинированием у видов рода Populus.

Способ получения полиплоидов откладывает отпечаток на их многие показатели. Полиплоиды, полученные в сочетании с гиб­ридизацией (мейотические и зиготические), более гетерозиготны, сбалансированы, фертильны и продуктивны, а поэтому более при­годны для селекции, чем митотические, возникшие за счет просто­го умножения числа хромосом, содержащихся в вегетативных час­тях растений.

На первых этапах развития полиплоидные растения отличаются от своих диплоидных собратьев по следующим признакам: угнетен­ный или мощный рост; наличие листовых пластинок, сидящих на утолщенных коротких черешках; появление кожистых листьев темно-зеленой окраски; присутствие морщинистых асимметричных листовых пластинок; увеличенные размеры устьичных клеток и уменьшенное их количество на единицу площади листа; большое количество хлоропластов в замыкающих клетках устьиц; большие размеры пыльцевых зерен и большее число пор на их экзине. Окон­чательный отбор полиплоидов проводят только на основании пря­мого подсчета числа хромосом в их соматических клетках. Свой­ства экспериментальных полиплоидов лесных древесных растений Могут проявиться не сразу, а постепенно в течение онтогенеза. Поэтому изучение и отбор индуцированных растений должны проводиться на протяжении нескольких лет.

Ф.Л. Щепотьев (1982) отмечает, что первые тетраплоиды у со­сны были получены Мировым и Стокуэллом в 1939 г. Затем в опытах Н. Jensen and A. Levan были выделены тетрашюиды секвойи ги­гантской. Д.А. Комиссаров получил триплоидные растения у сосны обыкновенной. В бывшей ГДР в результате колхицинирования се­мян выявлены тетраплоиды у ели обыкновенной, а у девяти видов пихты получены как тетраплоиды, так и октоплоиды.

Значительно шире полиплоидия распространена среди листвен­ных пород. Особенно много полиплоидных форм отмечено в семей­ствах Salicaceae, Betulaceae, Rosaceae, Fagaceae и др. Ниже приведе­ны данные по получению спонтанных (найденных в природе) и индуцированных полиплоидов у некоторых древесных пород.

Особый интерес представляет исследование полиплоидии рода дуба из семейства Fagaceae. У большинства его видов галоидное число хромосом равно 12, а диплоидное — 24. Однако у ряда севе­роамериканских видов дуба (каштановый, виргинский, мериленд­ский, Мишо) гаплоидное число хромосом равно 6, а диплоидное 12. Наличие в роде Quercus двух разных групп по кариотипу позво­ляет предположить, что виды с 2л = 24 являются тетраплоидами, а с 2n =12 — диплоидами. Следовательно, считающийся диплоидным Q. robur L. должен бы рассматриваться как тетраплоид. Спонтанные полиплоиды дуба черешчатого возникают также из многоза­родышевых желудей. Впервые триплоиды такого типа были заме­чены в Швеции. В Воронежской области естественный триплоид дуба был обнаружен В.В. Иевлевым (В.В. Иевлев и др., 1978). Ис­следования, проведенные в лесах Донецкой области, показали, что встречаемость спонтанных триплоидов среди проростков дуба че­решчатого может достигать 1,2%.

Искусственная полиплоидизация дуба черешчатого с помощью колхицина была проведена в Швеции в 1939 г. При этом были по­лучены миксоплоидные ткани с тетраплоидными (4 п =48) клетка­ми. Близкие результаты получены и Ф.Л. Щепотьевым.

В семействе Salicaceae наиболее известны спонтанные триплои­ды осины. Выделены спонтанные и искусственно полученные по­липлоиды у тополей белого, сереющего, черного и бальзамическо­го, а также у ряда ив. Некоторые данные по полиплоидам можно найти в разделах, посвященным частной селекции этих пород.

В семействе Betulaceae полиплоиды встречаются в родах березы, ольхи и граба. Так, береза пушистая, распространенная в более су­ровых условиях севера России, является тетраплоидом (4л = 56), в то время как более южный вид (береза повислая) относится к диплоидам (2n = 28). Другие северные виды обладают еще более высокой плоидностью. Так, береза желтая (В. lenta) — гексаплоид (6и = 84), даурская — септаплоид (7n = 98). В естественных насаждениях встречаются также триплоидные формы. С помощью колхицина X. Йонссон в Швеции получил тетраплоидные растения ольхи черной. Последующим скрещиванием с диплоидными растениями он создал триплоидные формы, которые превосходили диплоидные контрольные растения ольхи черной по продуктивности древесины на 55%.

Полиплоидные формы выделены также среди представителей семейств конскокаштановых, кленовых, липовых, лоховых (обле­пиха) и др. (Г.Ф. Привалов, 1974; Ф.Л. Щепотьев, 1982; Н.С. Ща­пов, В.К. Креймер, 1988). Во многих случаях они представляют прак­тический интерес.

5.4. Селекция методом культуры клеточных тканей и клеток

Введение культуры клеточных тканей и клеток (метод in vitro) может способствовать созданию лучших сортов, более быстрому использованию ценного материала и уникальных форм. В стериль­ную культуру тканей и клеток в принципе возможен перевод всех частей растений, однако для исследований в области селекции имеет значение культура только таких органов, в которых можно индуци­ровать органогенез. К ним можно отнести верхушки побегов (апи­кальная меристема и дифференцированные ткани побега); цветко­вые почки, завязи, семяпочки; пыльники, пыльца; зародыш; клет­ки; ткань каллуса.

Применение метода охватывает следующие этапы работы: вы­бор подходящего для решения поставленной задачи сорта (геноти­па) и нужной части растения для закладки культуры; закладка сте­рильной культуры; создание условий (питательная смесь, темпера­тура, освещение и др.) для стимуляции желательного процесса раз­вития; регенерация жизнеспособных растений; перевод отобранных для селекции растений в грунтовую культуру для включения их в дальнейший селекционный процесс.

Задачи, решаемые этим методом в селекции, можно сгруппиро­вать в три взаимно связанные группы: 1) расширение генетической базы селекции растений путем получения нового исходного мате­риала; 2) сохранение и размножение ценных элитных растений и линий; 3) получение и сохранение безвирусного материала расте­ний. Ниже перечислены некоторые конкретные методы, которые можно использовать для решения этих задач.

Расширение генетической базы для селекции растений. Обычные Методы селекции, основанные на внутривидовой гибридизации и отборе, как правило, ведут к обеднению генетической изменчивости и сужению генетической базы, что влечет за собой потерю ус­тойчивости создаваемых генотипов и их популяций. Эффективность селекции в будущем можно обеспечить только путем постоянного расширения ее генетической базы, что можно осуществить метода­ми культуры тканей и клеток. Для этого используют методы сома­тической межвидовой гибридизации, оплодотворения и эмбрио-культуры, культуры пыльников, пыльцы и отдельных клеток in vitro и сомаклональной селекции.

Сохранение и размножение in vitro ценных элитных растений и линий применяется с целью получения генетически идентичных клонов. При этом обеспечивается:

Для осуществления этих задач используются методы клониро­вания на основе меристем верхушек побегов в стерильных услови­ях, а также регенерации жизнеспособных растений из других орга­нов (стеблей, кусочков листа, органов цветка, луковиц и др.).

Получение и сохранение безвирусного материала. Эти методы по­лучили распространение в практике сельского хозяйства для осво­бождения от вирусов вегетативно размножаемых растений. Уста­новлено, что концентрация вирусов в растении снижается по мере приближения к конусу нарастания. Сам конус нарастания часто бывает свободным от вирусной инфекции. Это и было использова­но для оздоровления материала путем изолирования меристемы в стерильных условиях и доведения ее до дифференциации in vitro. Изоляция меристемы размером 0,05-0,1 мм очень сложна. И успех дифференциации растений из нее невелик. Поэтому вместе с ней изолируют первые листовые примордии и тогда говорят о верхушке побега, которая имеет размер 0,1-1 мм. Благодаря этому хотя и ог­раничивается надежность получения безвирусного материала, но зато повышается степень его дифференциации. Кроме того метод становится удобным для практического использования. Культивирование производят на питательных средах Мурасиге и Скуга (см. табл. 10.1), Байса, Уайта и Хеллера.

Кратко рассмотренные в настоящем разделе методы широко рас­пространены в мире и продолжают совершенствоваться. Так, по некоторым данным (Г.П. Бутова, 1995 и др.), к началу 90-х годов в 15 странах Европейского сообщества работало более 250 лаборато­рий культуры in vitro, из которых примерно половина в коммерчес­ких целях. Из 550 возделываемых in vitro видов значительное коли­чество составляли древесные и кустарниковые. При этом розой за­нимались в 45 лабораториях, рододендроном — в 25, березой — в 19, дубом — в 18, тополем — в 12, сосной и елью — в 15.

В США насчитывается 270 промышленных лабораторий, в том числе и по древесным породам. В середине 80-х продукция расте­ний, размноженная методом культуры тканей, составила: 50 млн штук в США, 53 млн штук в Голландии, 10 млн штук в ФРГ, около 28 млн штук в Италии.

В бывшем СССР и в России получением селекционного матери­ала этими методами успешно занимались ряд научных лаборато­рий Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Мичуринска и др. Однако в последние годы масштабы исследований сократились, хотя перспективность их остается несомненной.

В целом, культура тканей предоставляет новые возможности для повышения эффективности селекции растений. Кроме того, с ее помощью можно создавать новые ценные сорта.

* *

Методы селекции лесных древесных пород, описанные в настоя­щей главе, начали развиваться относительно недавно. Поэтому они и названы в отличие от отбора и гибридизации, нетрадиционными. Стартовые исследования для части из них были начаты в первой половине XX века, но основные успехи достигнуты во второй поло­вине этого века. В последние годы получила развитие идея сочетания традиционных и нетрадиционных методов для более успешного вы­ведения хозяйственно ценных форм.

Однако, несмотря на прогресс селекции, достигаемый этими ме­тодами, широкому их практическому использованию препятствует ряд проблем. Они заключаются в том, что эти методы довольно дорогие, требуют специально оборудованных лабораторий, приборов и расходных материалов. Кроме того, как и для новых гибридов и от­дельно отобранных лучших деревьев, существуют трудности массового размножения ценных форм трудно черенкующихся видов. С другой стороны, использование метода культуры клеток и клеточных тканей позволит преодолеть и этот барьер. Например, успешные опыты по клеточной репродукции дуба проведены во Франции. По­этому необходимы более активные усилия по разработке методов вегетативного и клонального микроразмножения трудно черенкую­щихся форм лесных древесных пород.

Одним из способов преодоления проблемы является также созда­ние биклоновых семенных плантаций из диплоидных и тетраплоидных растений с целью получения хозяйственно ценных триплоидных форм. В будущем возможна разработка и других эффективных ме­тодов сохранения и размножения ценных генотипов лесных древес­ных пород, выведенных нетрадиционными методами селекции.

Вопросы для самопроверки

  1. Охарактеризуйте виды мутаций, используемые в селекции.

  2. Что такое полиплоидия и её возможности в селекции лесных древесных пород?

  3. Дайте краткую характеристику метода культуры тканей и его использования в селекции лесных древесных пород.

  4. Покажите возможности и направления экспериментального мутагенеза.

  5. Опишите физические методы получения мутантов, ионизирующие и неионизирующие излучения.

  6. Приведите результаты, полученные у лесных древесных пород при использо­вании физических методов мутагенеза.

  7. Охарактеризуйте химические методы получения мутантов, приведите класси­фикацию мутагенов и результаты их применения у лесных древесных пород.

  8. Опишите экспериментальную полиплоидию лесных древесных пород. Приве­дите характеристики митотического, мейотического и зиготического методов получения полиплоидов.

  9. Что такое спонтанные и индуцированные полиплоиды лесных древесных по­род? Приведите примеры.

  10. Охарактеризуйте селекцию методом культуры клеток и клеточных тканей in vitro: этапы, задачи и методы.

  11. Приведите некоторые результаты использования методов культуры тканей у лесных древесных пород.

  12. Укажите основные проблемы практического использования нетрадиционных методов селекции и пути их преодоления.