Состав некоторых питательных сред (из Ahuja, 1983, концентрация вещества указана в миллиграммах на литр)

Обязательным условием является присутствие в среде кроме эле­ментов питания гормональных факторов или имитаторов их дей­ствия. Известно пять групп соединений, относящихся к категории фитогормонов. Это цитокинины, ауксины, гиббереллины, абсцизовая кислота и этилен. При in vitro было выявлено, что для дедифференциации, превращения специализированной клетки в меристематическую, способную к делению, необходимо участие двух и более гормонов, относящихся к разным группам.

Цитокинины снимают апикальное доминирование и индуциру­ют развитие пазушных почек, нарушают покой и стимулируют рост покоящихся органов. Они регулируют рост соматических зароды­шей и формирование растений; необходимы для дифференциации стеблевых почек в культуре каллусных клеток и при регенерации побегов из клеток эксплантов. К группе цитокининов относятся: кинетин, БАП (6-бензиламинопурин), зеатин и др. Дополнитель­ное введение в питательную среду некоторых аминокислот — тиро­зина, фенил-аланина, а также фосфатов, способствует усилению эффекта цитокининов.

Ауксины влияют на деление, растяжение клеток и дифференцировку. Наиболее выраженный органогенный эффект ауксина — это стимуляция образования корней. К группе ауксинов относятся: ИУК (β-индол-3-уксусная кислота), индолилмасляная кислота (ИМК), нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4-D.

Гиббереллины — обширный класс соединений, включающий более 30 веществ. В микроразмножении растений в основном ис­пользуется гибберелловая кислота (ГК). Экзогенные гибберелли­ны усиливают рост и вытягивание стебля, листьев. Гиббереллины вносят в питательную среду в основном с целью ускорить рост сфор­мировавшихся почек и получить растения с хорошо развитой над­земной частью.

С помощью низких концентраций экзогенных фитогормонов принципиально возможна индукция и стимуляция различных морфогенетических реакций в культуре тканей. При высокой гор­мональной насыщенности питательной среды наблюдается угнете­ние общей активности клеток вплоть до их гибели. Эту специфику реакций культивируемых тканей и органов растений на введение фитогормонов следует учитывать при использовании регуляторов роста с целью размножения растений (Н.В. Катаева, Р.Г. Бутен-ко, 1983).

Процессы индукции органогенеза и соматического эмбриогене­за обнаруживают различную зависимость от экзогенных фитогор­монов. Если индукция корнеобразования четко связана с увеличени­ем концентрации ауксина в питательной среде и то же самое можно признать в отношении кинетина в побегообразовании, то эмбрио­генез в достаточной степени независим от экзогенных фитогормо­нов. Только первые моменты индукции требуют присутствия гормо­нов, тогда как дальнейшее развитие зародыша является процессом, не зависящим от экзогенных гормональных факторов. Развиваю­щийся зародыш сам делается источником необходимых для его раз­вития гормонов (Р.Г. Бутенко, 1975).

В целях экономии труда и времени при создании питательных сред готовят исходные запасные растворы. Рецепты запасных ра­створов для приготовления питательной среды Мурасиге — Скуга приведены ниже (концентрация указана в миллиграммах на литр).

Раствор I NH₄N0₃ 33 000

KNO, 38 000

СаС1₂ 2Н₂0 8 800

MgS0₄ 7 Н₂0 7 400 КН₂Р0₄ 3 400

Раствор II

KJ 166

Н,В0₃ 1 240

MnSo₄ 4H₂0 4 460

ZnS0₄ 7H₂0 1 720

Na₂Mo0₄ 2H₂0 50

CuSo₄ 5H₂0 5

СоС1₂ 6Н₂0 5

Раствор III FeSO„ 7H₂0 5 560

Na₂EDTA 2 Н₂0 7 460

Раствор IY

Иноситол 20 000

Никотиновая к-та 100

Пиридоксин НС1 100

Тиамин НС1 100

Глицин 400

При приготовлении раствора III FeS0₄ 7H₂0 и Na₂EDTA 2H₂0 растворяют отдельно в 450 мл дистиллированной воды (подогревая и постоянно помешивая раствор), затем смешивают, устанавлива­ют рН=5,5 и добавляют воды до 1 л. Последовательность приготов­ления питательной среды с использованием запасных растворов следующая:

• Необходимое количество агара и сахарозы растворяют в 750 мл дважды (для гарантии стерильности) дистиллированной воды. Де­лают это на водяной бане при повышенной температуре или в авто­клаве при пониженном давлении. Конечная концентрация агара должна быть 0,8-1,0%.

• Добавляют по 50 мл запасных растворов I и II и по 5 мл запас­ных растворов III и IY.

• Количество раствора доводят до 1 л.

Готовая среда охлаждается при комнатной температуре и хранит­ся при 4°С.