3.3. Проведение селекционно-племенной работы

в различных типах форелевых хозяйств

Начальным этапом селекционно-племенных работ, независимо от применяемых методов селекции, является оценка производителей ремонтно-маточного стада по массоразмерным и репродуктивным признакам.

Оценку самок и самцов каждой породной и возрастной группы проводят в период нереста. При большой численности производителей оценивают часть рыб, при этом объем рэндомной выборки должен составлять не менее 10 % особей (Терентьева, 1987; Голод и др., 1995;)

Срок созревания и длительность нереста у самок зависят от возраста рыб, принадлежности к породной группе, а также от внешних факторов, основными из которых являются температура оды и фотопериод. В связи с тем, что срок нереста самок характеризуется сравнительно высокой повторяемостью, этот признак может быть направленно изменен во времени. Поэтому необходимо фиксировать ежегодные данные по динамике нереста самок.

Самцы созревают, как правило, раньше самок на 1-1,5 месяца и продуцируют сперму в течение 3-5 месяцев. Их можно отцеживать несколько раз в сезон. Оценку самцов целесообразно проводить до наступления нереста самок в целях рационального распределения работ. Кроме того, можно заранее отобрать самцов с высокими рыбоводными качествами для последующей постановки скрещиваний.

Оценка самок по репродуктивным признакам

Для репродуктивной оценки самок определяют рабочую плодовитость рыб, диаметр и массу икринок.

Известно, что при перезревании икры размер икринок может увеличиваться, поэтому не следует допускать присутствия в выборке перезревших самок. Икру от зрелых самок отцеживают либо в день просмотра, либо на следующий день. При температуре воды 5-7°С самок просматривают через 5-7 суток, а при 9-11°-через 3 суток.

Рабочую плодовитость определяют либо весовым, либо объемным методом. Всю порцию икры измеряют или взвешивают, затем просчитывают число икринок в единице массы или объема и определяют общее количество икры.

Определением размера и массы икринок завершают оценку самок, и эти показатели являются исходными параметрами в характеристике потомства. Они тесно связаны с размерами будущих личинок и количеством питательных веществ в желтке, что в свою очередь влияет на сроки перехода личинок к активному питанию и их. выживаемость.

Важным критерием оценки качества икры в потомстве отдельных самок является величина вариабельности по размеру и массе. Икра с высокими показателями изменчивости по этим признакам, как правило, отличается пониженной жизнеспособностью.

Измерения икры обычно проводят на фиксированном материале. Для этого пробу из 50 или 100 шт. икринок помещают в 4 %-ный раствор формалина. Через 7-10 дней, когда фиксация произойдет полностью и вес икры стабилизируется, измеряют вес и диаметр с помощью торзионных весов и бинокуляра. Данные измерений статистически обрабатывают и определяют средние значения массы и диаметра и коэффициент их изменчивости.

Оценка самцов по репродуктивным признакам

Для характеристики самцов используют значения объема эякулята, концентрации спермиев и время подвижного состояния сперматозоидов.

Известно, что во время нерестового сезона у самцов происходит изменение репродуктивных показателей с постепенным увеличением количества и улучшением качества спермы к середине нереста и с последующим их снижением. Учитывая это обстоятельство, оценку самцов следует проводить не в самом начале их нереста, а ближе к его середине, но, по возможности, раньше бонитировки самок, как уже указывалось выше.

Измерения проводят в следующем порядке. Единовременную порцию спермы от каждого самца отцеживают в отдельную мерную пробирку с точностью деления до 0,1 см и определяют объем эякулята.

Затем измеряют продолжительность подвижного состояния спермиев. Методика определения общеизвестна: в каплю воды на стекле под микроскопом помещают сперму и устанавливают время начала и окончания движения спермиев с помощью секундомера.

Известно, что активность спермиев меняется в зависимости от температуры окружающей среды. Так как по каждому показателю оценивают сразу несколько самцов одновременно, то от момента взятия спермы до определения ее активности проходит какое-то время, в связи с чем следует избегать нагревания или охлаждения пробы. Кроме того, вода, в которой ведется наблюдение за подвижностью спермиев, также не должна отличаться по температуре от воды, в которой содержатся самцы.

Концентрацию спермиев можно определить методом, используемым для подсчета эритроцитов с помощью камеры Горяева или с применением фотоэлектрокалориметра. Более быстрым способом оценки одновременно нескольких самцов является определение концентрации спермиев по показателю сперматокрита. Он заключается в следующем:

- из всего эякулята берут пробу спермы в капиллярную градуированную центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 15 мин при 5000 оборотов в минуту. Центрифугировать сперму следует не позже 1,5 ч после отцеживания эякулята, так как с увеличением времени хранения спермы даже в оптимальных температурных условиях результат анализа значительно изменяется;

- по делениям центрифужной пробирки определяют объем плотного осадка центрифугата, объем центрифугированной пробы и вычисляют величину сперматокрита как отношение плотного осадка к общему объему центрифугированной пробы, %;

- концентрацию спермиев определяют по формуле

у= а +bх,

где у-концентрация спермиев, млн./мм;

х-величина сперматокрита, %;

а, b-коэффициенты регрессии (для самцов радужной форели

а= 1,18, b=0,42).

По показаниям объема эякулята и концентрации спермиев вычисляют рабочую плодовитость самцов.

Данные, полученные в результате бонитировки самок и самцов, подвергают статистической обработке с определением по каждому признаку средней арифметической (X), ее ошибки (Sх), среднего квадратичного отклонения () и коэффициента вариации (V, %) (Голод и др., 1995)

Статистическая обработка завершается корреляционным анализом с целью выявления взаимосвязей признаков между собой.

Следующий этап селекционно-племенных работ-разработку схемы формирования ремонтно-маточных стад-осуществляют на основании проведенной оценки производителей и с учетом биотехнических особенностей разведения, присущих разным типам хозяйств.

Формирование ремонтно-маточных стад в холодноводных садковых хозяйствах

Oсновная отличительная особенность садкового форелеводства-сильные колебания абиотических факторов. Это обстоятельство имеет решающее значение при выборе методов селекционно-племенной работы.

В нестабильных условиях выращивания селекционное преимущество имеют гетерозиготные особи, за счет которых можно формировать маточные стада с широким спектром адаптации. В этом случае неприемлемы методы индивидуального или семейного отбора, при которых неизбежно снижается уровень генетического разнообразия. Высокой степени гетерогенности маточных стад можно достичь массовым отбором производителей, а также осуществлением аутбредных скрещиваний не менее 30 пар производителей.

Для скрещиваний отбирают самок и самцов по массоразмерным и репродуктивным показателям, а также по срокам нереста самок в нерестовом сезоне.

С целью повышения общей продуктивности разводимых рыб целесообразно применять схему 2- или 3-отводочного разведения с тем, чтобы использовать эффект гетерозиса межотводочных скрещиваний (Голод, 1995).

Формирование маточных стад внутри отводок

На основании анализа данных по динамике нереста производителей определяют сроки созревания самок в сезоне, наиболее благоприятные для последующего выращивания потомства, и выделяют группу рыб, с которой будет проводиться дальнейшая работа.

Особое внимание следует уделить обоснованию интервала значений признака, по которому ведется отбор.

Многочисленные данные и опыт селекционеров свидетельствуют о том, что отбор на племя особей, показатели которых в существенной мере отклоняются от средних показателей по стаду, приводит к уменьшению генетического разнообразия, потере ценных генетических комбинаций и, как правило, к снижению общей продуктивности и жизнестойкости потомства. Кроме того, выбор особей «рекордистов», обычно весьма немногочисленных, сужает возможности постановки скрещиваний в масштабах, необходимых для практической селекции в промышленных хозяйствах.

Поэтому при отборе рыб по показателям, близким к средним, мы сохраняем не только их высокое генетическое разнообразие, но и оставляем на племя наиболее многочисленную и соответственно наиболее приспособленную к конкретным условиям разведения группу рыб.

Вместе с тем выбор для воспроизводства особей только из модальной группы ограничивает возможности прогресса породы или породной группы, из чего следует, что необходим отбор самок и самцов с показателями выше средних по стаду.

Учитывая то обстоятельство, что оценка самок будет проведена не по одному признаку, нам следует на первом этапе отбора по весу тела установить такие границы, которые позволили бы сохранить необходимое число рыб для дальнейшей селекции их по другим критериям.

Отбор по массе тела целесообразно проводить в интервале

0,5-х-1,5. В этом случае мы сохраняем достаточно многочисленную модальную группу рыб, средняя масса которых несколько выше этого показателя по стаду. Этот этап отбора можно проводить перед нерестом.

Второй этап отбора проводят во время нереста. Отбирают самок по рабочей плодовитости и массе икринок, показатели которых превышают средние значения по стаду. Напряженность отбора по репродуктивным признакам определяется количеством производителей, необходимых для формирования маточного стада.

При формировании элитной группы самцов оставляют рыб, не крупных по весу тела, но с высокой рабочей плодовитостью. Вначале проводят отбор по массе тела в интервале 0,5-х-1,5, а затем по репродуктивным показателям, превышающим средние значения по стаду. Численность отобранных рыб определяется потребностью хозяйства.

Скрещивание отобранных производителей проводят по общепринятой методике: икру от нескольких самок осеменяют спермой нескольких самцов.

Формирование ремонтной группы

Сравнительный анализ применения двух схем массового отбора по массе тела (однократного на молоди и двуступенчатого на сеголетках и двухгодовиках) показал, что они одинаково влияют на рыбоводно-биологическую и генетическую гетерогенность рыб ремонтной группы. С рыбоводной точки зрения, существенное пре­имущество имеет однократный ранний отбор.

Его проводят следующим образом:

- по достижении молоди средней массы около 2 г берут репрезентативную выборку в количестве не менее 100 особей;

- проводят индивидуальное взвешивание рыб с точностью до 0,1 г;

- строят вариационный ряд или вычерчивают кривую распределения частот рыб по массе тела и определяют граничное значение массы тела крупных рыб, составляющих 10-15 % выборки;

- среди всей группы молоди проводят отбор, оставляя на племя особей, индивидуальная масса тела которых лежит в интервале, определенном в предыдущем пункте.

С целью повышения выхода товарной продукции наиболее целесообразно применять схему 2- или 3-отводочного разведения с тем, чтобы использовать эффект гетерозиса межотводочных скрещиваний. При этом отводки могут состоять или из разных пород форели (форель камлоопс, стальноголовый лосось, форель Дональдсона), или из групп рыб, различающихся по генетической структуре.

В условиях садкового разведения каждая отводка внутри должна сохранять высокую гетерогенность.

Формирование ремонтно-маточных стад в холодноводных хозяйствах, использующих артезианские воды

В хозяйствах такого типа производители радужной форели могут отличаться узким спектром генетического разнообразия, проявляя при этом высокие продуктивные качества.

В основу методов формирования маточных стад могут быть положены формы индивидуального отбора, в частности сибселекция. Основными признаками при отборе будут являться темп роста и выживаемость.

Для получения товарной продукции высокого рыбоводного качества целесообразно применять двух- или трехотводочное разведение. Скрещивание производителей внутри каждой отводки необходимо проводить по схеме 1♀х1♂.

Первый этап создания породы или породной группы радужной форели методами сибселекции связан с оценкой производителей исходного маточного стада. Методика оценки описана в начале этой главы.

После анализа данных бонитировки приступают к выбору производителей-основателей отводки. Критериями отбора являются вес и размер тела, а также показатели рабочей плодовитости самок и самцов. Границы отбора по этим признакам остаются такими же, как и при массовом отборе:

- для массы тела самок и самцов 0,5-х- 1,5;

- рабочая плодовитость должна быть выше среднего значения по стаду.

Из рэндомной выборки отбирают необходимое число самок и самцов для постановки парных скрещиваний. Объем выборки должен составлять не менее 10 % от численности маточного стада. Исходное количество парных скрещиваний должно быть не менее 30. Основными показателями при оценке семей являются выживаемость на различных этапах онтогенеза и скорость роста.

Отбор семей по выживаемости проводят последовательно по результатам инкубации икры и выдерживания личинок. Отбраковывают семьи, выживаемость в которых ниже нормативной. При дальнейшем выращивании ведется постоянный учет погибших особей в каждой семье.

Отбор по массе тела проводят по достижении рыбами годовалого возраста. Оставляют семьи с наиболее высокими показателями роста и выживаемости за весь период наблюдений.

В выбранных семьях отбраковывают около 30 % рыб, отставших в росте. Дальнейшее выращивание сибсов можно проводить совместно, при этом представители каждой семьи должны быть помечены серийной меткой.

При созревании рыб проводят бонитировку ремонтного стада и корректирующий отбор. Удаляют рыб с дефектами развития, тугорослых и слабых особей.

Выбор производителей-продолжателей отводки осуществляют в семьях, характеризующихся хорошим темпом роста и выживаемостью рыб, наиболее высокой плодовитостью самок и самцов. Средний размер икринок у отобранных самок должен быть не ниже, чем в исходном стаде (Голод и др., 1995).

Дальнейшая работа по воспроизводству новых поколений селекции осуществляется по той же схеме.

Для получения товарной продукции скрещивают производителей разных отводок.

Формирование ремонтно-маточных стад в хозяйствах, использующих сбросные теплые воды ГРЭС, ТЭС, ТЭЦ и АЭС отличается определенной спецификой и требует необходимость выбора в качестве основного селекционного признака теплоустойчивость организма. Отбор на повышение теплоустойчивости способствует увеличению темпа роста рыб за счет большего соответствия их индивидуальных тепловых потребностей условиям содержания и снижению гибели рыб в период максимального прогрева воды. Терморезистентность (теплоустойчивость) применима в качестве селекционного признака при использовании обоих основных способов отбора - массового и индивидуального.

Массовый отбор по теплоустойчивости

Прямой отбор по резистентности не может быть рекомендован вследствие гибели в процессе отбора значительной части посадочного материала, поэтому следует использовать косвенный отбор по теплоустойчивости. Методика основана на взаимодействии положительного реотаксиса, имеющегося у форели, и реакции избегания высоких температур. Принцип заключается в том, что рыб помещают в термоградиентные условия с быстронарастающим температурным фоном (Голод, 1984, 1987, 1988)

Практически отбор осуществляют следующим образом: рыб средним весом 0,5-0,7 г помещают в прямоточные лотки и после двух-трехчасовой адаптации начинают повышать температуру подаваемой воды. Скорость подъема температуры должна быть 0,05-0,15 град/мин. Расход воды устанавливают от 20 до 60 л/мин в зависимости от размера лотка. Количество рыб в лотке должно соответствовать нормативному при данной проточности. Обязательным условием для отбора является возникновение перепада температуры от втока к вытоку минимум на 4-5⁰С. Для этого необходимо снизить температуру воздуха в помещении и удлинить путь воды по лотку (установив в шахматном порядке перегородки на ²/₃ ширины лотка).

Первоначально основная масса рыб собирается в области втока, но когда температура воды поднимается до 23-26⁰С, часть рыб перемещается к вытоку, где вода холоднее. В это время, визуально определив, что на втоке осталось 5-10 % рыб, необходимо отделить их сетчатым экраном. После этого подогрев воды прекращают и плавно, со скоростью не более 0,05 град/мин, температуру доводят до исходной.

В результате такого отбора на племя оставляют рыб, у которых положительный реотаксис доминирует над реакцией избегания высоких температур. При напряженности отбора 5 % эти рыбы обладают теплоустойчивостью на 15 % выше, чем особи рэндомной выборки. Отобранных рыб выращивают согласно нормативам для племенной группы ремонтного стада. Их воспроизводство осуществляют методами массового отбора.

Индивидуальный отбор

Первый этап индивидуального отбора по теплоустойчивости заключается в оценке производителей исходного стада по рыбоводно-биологическим показателям, в выборе производителей – основателей отводки и постановке парных скрещиваний (см. раздел по семейной селекции).

Второй этап работ по созданию "теплолюбивой" породы заключается в выборе лучших семей. В период инкубации икры и выдерживания личинок сибсов оценивают по проценту выживаемости эмбрионов. Семьи, в которых гибель эмбрионов превышает нормативы, выбраковывают. Сразу после перехода рыб на активное питание сибсов оценивают по средней теплоустойчивости рэндомной выборки (Голод, 1988; Голод и др., 1995).

При определении терморезистентности форели следует соблюдать следующие обязательные условия:

1. Предварительная адаптация рыб в течение 2 суток к исходной температуре воды, которая должна быть в пределах 5-10⁰С.

2. Скорость подъема температуры воды около 0,1 град/мин.

3. Тестирующая температура 28-30⁰С.

4. Относительное содержание кислорода 100 %.

5. Идентичность условий проведения опытов (исходная и конечная температура, скорость подъема температуры, содержание кислорода и др.).

При проведении работ используют различное оборудование: в цехе водоподготовки с нагревателями, дегазаторами и оксигенераторами – стандартные рыбоводные емкости; если такой возможности нет, то можно использовать аквариумы. Для этого необходимы аквариумные нагреватели, термореле и микрокомпрессор. Мощность нагревателя регулируют в зависимости от объема аквариума так, чтобы была обеспечена необходимая скорость подъема температуры и ее равномерное нагревание.

За точку отсчета времени берут момент достижения тестирующей температуры. Через каждые 5 мин из аквариума удаляют погибших рыб .В результате получается частотное распределение рыб по индивидуальному времени переживания , на основании которого рассчитывают средне значение, ошибку среднего и коэффициент вариации. Для дальнейшего выращивания оставляют 3-4 семьи с наиболее высокой теплоустойчивостью. Селекционный дифференциал тем выше, чем больше было поставлено парных скрещиваний. Так, при выборе 4 семей из 20 их теплоустойчивость на 15-20 % выше средней

Третий этап заключается в выращивании рыб до полового созревания. При этом семьи оценивают по выживаемости и темпу роста . На сеголетках проводят массовый отбор по весу тела напряженностью 50 %. При созревании самок семьи оценивают по репродуктивным показателям и качеству потомства. Отбирают лучшие семьи, и внутри каждой семьи осуществляют массовые скрещивания (Голод, 1984; Голод и др., 1995)

По результатам инкубации икры и выдерживания личинок определяют семью, в которой будут выбирать производителей – продолжателей отводки. Дальнейшая работа ведется по той же схеме.

Комбинированный отбор

При комбинированном отборе добавляется еще одна ступень- прямой отбор по теплоустойчивости на молоди наиболее резистентных семей. Методика проведения отбора аналогична методике постановки опытов по определению средней теплоустойчивости, за исключением конечной температуры, которая должна быть около 27°С. При этом, визуально определив, что погибло приблизительно 25 % рыб, подогрев отключают, за 10 мин температуру снижают до 20°C, затем постепенно доводят до исходной. В результате напряженность массового отбора по теплоустойчивости составит около 50 %.

3.4. Осуществление генетического мониторинга

Основной целью любых селекционно-племенных работ в аквакультуре является выведение пород рыб, характеризующихся определенными морфометрическими, рыбоводно-биологическими и другими показателями. В ходе создания и эксплуатации стада, как правило, происходит постепенное изменение его популяционной, в том числе и генетической структуры. Особенностью изменений, происходящих на генетическом уровне, является скорость этих изменений: изменения на генетическом уровне обнаруживаются практически в первом же поколении, в то время как изменения фенотипические могут проявиться лишь через несколько поколений. Именно по этой причине становится актуальным проведение мониторинга маточных стад рыб именно на генетическом уровне.

Основными методами мониторинга генетической структуры популяций является изучение:

- кариологического полиморфизма;

- полиморфизма структуры ДНК;

- белкового полиморфизма.

Анализ проведенных исследований позволяет сделать определенные выводы о методологических подходах при проведении генетического мониторинга маточных стад радужной форели.

Для полноценной характеристики генетической структуры маточного стада необходимо исследовать не менее 100 производителей, равномерно распределив выборку между самцами и самками. В результате по каждому из исследованных локусов окажется проанализировано 200 аллелей, что является достаточным для дальнейшей статистической обработки материала. При невозможности анализа собственно производителей можно провести косвенную оценку маточного стада путем определения генетической структуры молоди. В этом случае выборка обязательно должна быть представительна, т. е. должно быть проанализировано потомство от возможно большего количества производителей.

Методический сбор материала должен происходить в определенной последовательности. От каждой рыбы после измерений, взвешивания и определения пола берут образцы тканей в виде сыворотки крови, кусочков белковых мышц и печени. Электро-форетические разгонки осуществляют с использованием стандартных методик. Наилучшее разрешение и качество разгонок получается при использовании крахмального геля (для изоцитратдегидрогеназы) и полиакриламидного геля (для остальных локусов). Наиболее информативными из проанализированных нами полиморф­ных белковых локусов у радужной форели являются:

-мышечная аспартатаминотрансферраза ААТ-3;

-трансферрин Тf-1 сыворотки крови; печеночные супероксиддисмутаза S0D-1 и изоцитратдегидрогеназа IDН-3 и IDН-4.

При анализе частот аллелей перечисленных полиморфных белковых локусов могут быть получены разнообразные показатели, характеризующие особенности генетической структуры популяции (стада): доля полиморфных локусов, количество аллелей на локус, средний уровень гетерозиготности и др. Наиболее информативным и полно отражающим генетические изменения показателем является сам факт изменения частот аллелей полиморфных белковых локусов. Нестабильность частот белковых маркеров служит первым показателем происходящих (желательных или нежелательных) изменений генетической структуры того или иного маточного стада. Предложенные для форели полиморфные белковые локусы относятся к различным классам ферментов, и изменение их частот аллелей отражает изменения, происходящие во всем геноме маточного стада.

Периодичность проведения генетического мониторинга во многом зависит от поставленных селекционером задач и методов селекционно-племенной работы. При использовании в качестве основы массового отбора, незначительных отбраковок производителей и их большого количества сбор и анализ данных по генетическому мониторингу может проводиться один раз в 2-4 года. Применение индивидуального отбора требует ежегодного генетического мониторинга состояния маточного стада. Тактика организации и проведения генетического мониторинга маточных стад должна разрабатываться индивидуально для каждого конкретного хозяйства (Голод и др., 1995).