Изучение влияния полиэлектролитов на активность липазы из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus

Изучение влияния различных факторов среды на активность липаз представляется важным и перспективным как в фундаментальном, так и прикладном аспектах. В первую очередь это касается их использования в медицине (2). Так, управление липолитической активностью ферментов будет играть важную роль в новых методах лечения нарушений жирового обмена и в контроле за сердечно-сосудистыми заболеваниями. Не меньший интерес представляет практическое использование липаз в пищевой и других отраслях промышленности (3). Липазы микроорганизмов в сочетании с другими ферментами применяются для биологической очистки сточных вод. Липазы, гидролизующие триглицериды с образованием глицерина и жирных кислот, входят в состав набора реактивов для определения триглицеридов по глицерину в биологических жидкостях (2,3). Важную роль в оптимизации биотехнологических производств играет поиск новых экономичных источников липаз (например липазы бактериального или грибкового происхождения), а также выбор оптимальных условий проведения реакции (температура, рН среды, присутствие неорганических солей) (2).

_{Стремительное развитие биотехнологии и химической энзимологии, сформировавшихся на стыке ряда химических и биологических дисциплин, обусловлено созданием нового типа гетерогенных биологически активных катализаторов – иммобилизованных ферментов (1,4). Целью иммобилизации является повышение устойчивости ферментов к денатурирующим агентам и придание им заданных технологических свойств, в том числе возможности повторного использования и легкости выделения из реакционной смеси (4).}

_{Цель нашей работы – исследовать изменение ферментативной активности липаз животного и грибкового происхождения в присутствии полиэлектролитов полистиролсульфоната натрия (ПСС) и полидиаллилдиметиламмоний хлорида (ПАМА).}

_{Панкреатическая липаза свиньи является гликопротеидом, имеющим молекулярную массу порядка 50 000, оптимум рН 8-9 и оптимум температуры 40ºС (1). Позиционная специфичность по отношению к первичным эфирным связям имеется, но не во всех случаях. Обычно этот фермент может гидролизовать также ди- и моноглицериды (5). Данный фермент эффективно расщепляет триглицериды, находящиеся в эмульгированном состоянии (2,3). Свойство липазы специфически гидролизовать сложные эфиры третичных спиртов широко используется для анализа и синтеза жиров и других глицеридов (6).}

_{В литературе очень мало данных о липазе, продуцируемой грибом Mucor javanicus (3). Из химических свойств выделенной липазы приводятся только данные о ингибировании липолитической активности диизопропилфторфосфатом, а цистеин и ЭДТА не влияли на активность. Данную липазу можно отнести к группе сериновых ферментов, однако она отличается от большинства других липаз рН оптимумом (около 5,5). Оптимум температуры для действия липазы равен 50ºС. Мм = 40 000 г/моль, рI = 4,68.}

_{Для изучения влияния полимерного окружения на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus были взяты противоположно заряженные полиэлектролиты: Na-полистиролсульфонат (ПСС) с молекулярной массой 70 000 г/моль использовался как полианион; полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПАМА) с молекулярной массой 450000 г/моль использовался как поликатион. Измерение активности липазы проводилось с помощью метода потенциометрического титрования по скорости гидролиза триацетина на автоматическом титраторе «PHM 290 pH-stat controller» (фирмы «Радиометр», Копенгаген) при рН=7,0 . Одна единица активности липазы соответствует 1 мкмоль уксусной кислоты, выделяющейся при ферментативном гидролизе субстрата триацетина в одну минуту. Относительная активность (в %) рассчитывалась как отношение активности опытной пробы к активности контрольной пробы.}

_{Активность липаз была измерена в присутствии ПАМА и ПСС в соотношениях липаза: полимер 1:1, 1:10, 1:100 при рН 7,0 и 25ºС. Как видно из таблицы, активность липазы существенно зависит от заряда полимера и от концентрации его относительно фермента, поскольку комплексообразование с полиэлектролитами приводит к закреплению определенной конформации фермента в каталитически выгодном или невыгодном положении ("открытая" и "закрытая" конформационная форма фермента).}

_{Таблица 1. Активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus при различных соотношениях липаза: полимер}

Максимальная активность липазы из поджелудочной железы свиньи наблюдалась при соотношении липаза:полимер равное 1:10 (в присутствии ПАМА она составила 94%, в присутствии ПСС – 117% по отношению к активности липазы в растворе без полиэлектролитов, принятой за 100%). Увеличение активности панкреатической липазы в комплексах с ПСС в соотношении 1:100 может быть объяснено процессом мицеллообразования ПСС и триглицеридов и последующим действием липазы на мицеллярные агрегаты субстрата. Снижение активности панкреатической липазы в комплексах с ПАМА в соотношении 1:100 может быть связано с тем, что отрицательно заряженная при нейтральных значениях рН липаза в процессе комплексообразования оказывается расположенной внутри сетки положительно заряженного полимера, молекулярная масса которого почти в 9 раз больше молекулярной массы липазы. В этих условиях активные центры липазы становятся менее доступными для субстрата.

Постепенное увеличение активности липазы из гриба Mucor javanicus (от 96% до 116%) в присутствии ПАМА при увеличении относительной концентрации полимера (от 1:1 до 1:100) возможно происходит за счет препятствия разворачиванию полипептидной цепи и стабилизации каталитически выгодной конформации липазы (имеющей суммарный отрицательный заряд при рН 7,0) в комплексе при большом избытке положительно заряженного полимера. Результаты полученные при исследовании активности грибковой липазы в комплексе с ПСС свидетельствуют о значительных изменениях активности липазы в присутствии отрицательно заряженного полимера. Наибольшая активация липазы из Mucor javanicus (152%) наблюдается в присутствии полимера при соотношении полимер: липаза = 1:1. Значительное уменьшение относительной активности, полученной при соотношении полимер: липаза = 1:10 (63%) возможно связано с ограничением доступа субстрата к активному центру фермента. Пространственная полимерная матрица, в которой иммобилизуется фермент, может препятствовать продвижению молекул субстрата в силу электростатических и диффузионных затруднений. Дальнейшее увеличение ферментативной активности (до 108%) при соотношении липаза: ПСС=1:100 можно объяснить преобладающим эффектом «мицелообразования» избытка ПСС и увеличением границы раздела фаз, что всегда приводит к увеличению относительной активности липаз (1,2,3).

Таким образом, изучено влияние концентрации положительно заряженного полиэлектролита полидиаллилдиметиламмоний хлорида на липазы из поджелудочной железы свиньи и Mucor javanicus. Наивысшая ферментативная активнось липазы из поджелудочной железы свиньи наблюдалась при соотношении липаза: ПАМА 1:10 (94%), а липазы из Mucor javanicus при соотношении 1:100 (116%). Исследовано влияние соотношения липаза:полимер в случае отрицательно заряженного полиэлектролита полистиролсульфоната натрия. При соотношениях 1:10 и 1:100 активность панкреатической липазы различалась незначительно и была максимальной (117 и 115% соответственно). Наивысшая ферментативная активность липазы из Mucor javanicus (152%) наблюдалась при мольном соотношении липаза: ПСС равном 1:1.

Полученные результаты важны для оптимизации биотехнологических и биохимических процессов с использованием иммобилизованных ферментов.

Литература

1. Изумрудов В. А., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Успехи химии, 1991. – т. 60. – С. 1570-1585.

2. Lipases, Part B: Enzyme Characterization and Utilization, in the ”Methods in Enzymology”, v.286, Ed. by B. Rubin and E. A. Dennis , Academic Press, New York, 1997. – p. 386-405.

3.Брокерхоф Х., Дженсен Р. Липолитические ферменты. М., «Мир», 1978. – 396 с.

4. Иммобилизованные ферменты / Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В. и др. – М.: Высш. шк., 1987. – 159 с.

5. Sarda L., Desnuelle P. Biochim. Biophis. Acta, 1958. – V. 30

6. Jensen R.G., Progr. Chem. Fats Other Lipids, 1971. – v. 11, р. 347