Разработка подходов к обнаружению вируса алеутской болезни норок на основе полимеразной цепной реакции

Алеутская болезнь (АБ) норок, вирусный плазмоцитоз, гипергаммаглобулинемия – контагиозная иммунокомплексная болезнь, вызываемая парвовирусом. Характеризуется распространенной пролиферацией плазматических клеток (плазмоцитоз), высоким подъемом уровня иммуноглобулина (гаммаглобулина), прогрессирующим исхуданием, жаждой, кровотечениями из носовой и ротовой полостей, гломерулонефритом, артериитом, гепатитом, а также резорбцией эмбрионов у самок. Отмечены и случаи менингоэнцефалита. У новорожденных щенков может протекать как острая интерстициальная пневмония с высокой летальностью. Кроме того, возникающая вследствие заражения вирусом АБ иммуносупрессия способствует развитию и отягощает течение других инфекций, к которым здоровые норки часто бывают даже невосприимчивы.

Впервые АБ описали Hartsough G.R. и Gorham J.R. в 1956 г. Первым доказательством инфекционной природы АБ послужили многочисленные случаи падежа алеутских норок после вакцинации их против чумы (Gorham J.R. et al., 1965) аутогенной формол-вакциной, изготовленной из селезенок норок, зараженных вирусом чумы (в то время отсутствовали эмбрион-вакцина и культуральная вакцина). Как теперь стало ясно, вакцина была контаминирована более устойчивым к формалину вирусом АБ. Хотя вакцина вызвала гибель cотен алеутских норок, не было сообщений о падеже норок дарк. По всей вероятности, в использованных для вакцины селезенках присутствовал низковирулентный штамм Пульман вируса АБ, способный вызывать гибель только алеутских норок. После этого стало видно, что алеутские норки наиболее чувствительны к АБ (Gorham J.R, 2000).

В СССР эта болезнь впервые зарегистрирована в 1965 г. (Бузинов И.А. с соавт., 1967а) и интенсивно изучалась Дукур И.И. с соавт. (1968 и др.), Берестовым В.А. и др. (1969), Слугиным В.С. с соавт. (1966-1982).

Норки фактически являются единственным восприимчивым видом, хотя с большой натяжкой можно говорить о незначительной чувствительности хорьков. У ряда животных и у человека вирус АБ не вызывает заболевания, хотя может продолжительное время (до 2-3 месяцев и дольше) персистировать в их организме (это доказывается биопробой и обнаружением специфических антител). Невосприимчив и человек, хотя характер гломерулонефрита и изменения ядер, фибриноидное изменение сосудов, лимфоплазмоклеточная реакция у норок имеют определенное сходство с таковыми у человека при системной красной волчанке (Ахназарова В.Д. соавт. , 1977; и др.).

Источником вируса являются – больные и вирусоносители, в организме которых он содержится во всех паренхиматозных органах и тканях, а также выделяется в окружающую среду со слюной, фекалиями и мочой, передается вертикальными и горизонтальными путями.

Вирус также может бессимптомно персистировать несколько недель или месяцев в организме лисиц, песцов, соболей, енотов, кроликов, разводимых в неблагополучных по АБ звероводческих хозяйствах, а также у диких зверей, собак, кошек и других животных, оставаясь патогенным для норок.

В организме норок вирус индуцирует чрезмерно высокую продукцию специфических антител, тем не менее не способных его нейтрализовать, вследствие чего сохраняется пожизненное одновременное присутствие вируса и антител в форме иммунного инфекционного комплекса. В естественных условиях заражение происходит алиментарным и аэрогенным путем, а также через кожу во время покусов зверей. В условиях зверохозяйств к факторам переноса добавляются оборудование и обслуживающий персонал. О возможности горизонтального и вертикального пути передачи вируса алеутской болезни было сообщено на 2-ом международном конгрессе звероводов (Scientifur 1980 4.1.38).

Непосредственно сам вирус не вызывает поражений и падежа (за исключением случаев интерстициальной пневмонии у новорожденных щенков), но инициирует неадекватно интенсивную продукцию антител, которые соединяются с вирусом и комплементом в форме иммунных комплексов и откладываются в клубочках почек, артериях и на поверхности эритроцитов. Одной из причин непропорционально высокой гуморального ответа является нарушение функции Т-лимфоцитов (An S.H. & Wilkie B.N., 1980). Несмотря на чрезмерный иммунный ответ полной нейтрализации вируса не происходит, из-за чего иммунные комплексы получили название инфекционных.

Как уже говорилось выше, вирус алеутской болезни норок способен инфицировать норку, ласку, куницу, соболя, выдру и скунса. Имеются данные о заражении вирусом АБ европейской норки, но этот вопрос недостаточно изучен. Помимо семейства куньих вирус АБН персистирует в других видах животных разводимых в неволе: лисице, песце и еноте. Однако только у норки и хоря он способен вызывать клинически выраженное заболевание (Oie et al., 1997).

Вирус АБН – автономный парвовирус, содержит одноцепочную линейную молекулу ДНК (размер генома составляет 4801 нуклеотида). Оболочка парвовируса - типичная икосаэдрическая частица, состоящая из 32 капсомеров. Каждый капсомер состоит из 60 асимметричных белковых субъединиц (протомеров). Протомер включает в себя 10 белков VP1 и 50 белков VP2 (Рис 1).

Рис.1 Компьютерная модель вируса алеутской болезни норок (Bloom,1999)

Вирионы АБН стабильны при рН 3,0 - 9,0, прогревании при 56 °С в течение часа, устойчивы к жирорастворителям, трипсину, инактивируются ультрафиолетовыми излучением, производными этиленимина, гидроксиламином, а также окисляющими агентами (Aasted, 1983).

Вирус, содержащийся в гомогенате органов, инактивируется 0,3% формалином в течение 48 часов при 37°С, но не инактивируется 0,4% формалином за 12 часов при 37°С.

Диагностику алеутской болезни проводят на основании эпизоотических, клинических, серологических, патологоанатомических и гистологических исследований.

Гистологические исследования в основном используются в научно-исследовательской работе, а эпизоотические, клинические, патологоанатомические и серологические методы используются для определения состояния хозяйства по алеутской болезни.

Крупным практическим достижением было применение Henson J.B. et al. (1962), Бузиновым И.А. и др. (1967) для массовой диагностики йодно-агглютинационного теста (ЙАТ, йодная проба), предложенного Mallen для выявления диспротеинемии и парапротеинемии. Дальнейшее развитие диагностики АБ связано с реакцией иммуноэлектроосмофореза (РИЭОФ), или встречного иммуноэлектроосмофореза (CIEP – по-английски) Cho H.J. и Ingram D.G. (1972), Слугин В.С. и Чеботарев М.И. (1974).

В настоящее время наибольшее распространение получили следующие методы диагностики на АБН:

Серологический тест, его аналогом в нашей стране реакция иммуноэлектроосмофореза (РИЭОФ). Впервые предложили в 1973 Cho и Ingram (Chо, Ingram, 1973). РИЭОФ выявляет не всех, а в среднем 97-98% инфицированных норок, причем не раньше, чем через 6-7 дней после заражения (обычно значительно позже). При этом следует подчеркнуть, что в свежем эпизоотическом очаге чувствительность РИЭОФ достигает 100%, а в стационарном – в среднем 85%. В свежем очаге количество реагирующих (их приравнивают к заболевшим) обозначают как инцидентность, в стационарном, где суммируют прежде заразившихся норок с новыми, - как превалентность.

Непрямой серологический тест (СЕР) предложен Aasted-ом в 1982 году.

Метод флюорисцирующих антител. Это более точный метод, но он более трудоемок, чем СЕР и требует специального оборудования.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) – тест-система. Выявляет антитела через 2 недели после экспериментального заражения. Незначительное потребление антигена и возможность одновременно обрабатывать большое количество образцов при массовом исследовании, обусловливают значительное снижение стоимости диагностики в сравнении с РИЭОФ.

Радиоиммунологический метод. К недостаткам можно отнести то, что в работе используется радиоактивный йод-125 и необходимы особые условия для постановки и использования этого метода.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), которой и посвящено наше сообщение.

Метод позволяет обнаруживать ДНК вируса АБН в минимальных количествах 1-10 нг. (Jackson, 1992). И в отличие от всех остальных методов дает возможность вести анализ объектов окружающей среды.

Исходя из этого, мы остановились на разработке диагностического теста, основанного на ПЦР.

Работа наша затруднялась тем, что вирус очень неоднороден по своему составу. Разные штаммы различаются участками генома назваными гипервариабельными и расположенными с первого по шестьсот тридцать восьмой нуклеотид.

Olofsson A. et al. (1999) исследовали 35 изолятов полевого вируса, полученных с 15 ферм Швеции и 3 ферм Финляндии, где АБ проявлялась клинически или обнаруживались серопозитивные по РИЭОФ норки. Была выявлена необычно высокая генетическая вариабильность вируса. При этом идентифицированы три филогенетические подгруппы вируса AБ. На одной ферме в одном случае изоляты вируса от двух животных имели полностью идентичные последовательности, тогда как на других фермах они были очень разными, отличаясь на 16% по нуклеотидной и на 26% по аминокислотной последовательностям.

Свою работу мы начали с анализа гипервариабельного генома вируса АБН. Для сравнения и анализа нуклеотидных последовательностей использовали все доступные нам данные о штаммах вируса АБН, изолированных в США, Европе и России.

На рисунке 2 приведены результаты сравнения последовательности ДНК гипервариабельного участка вируса АБН отечественного штамма П-1(ADV-P1) и изолята СТЛ-1(ADV-STL1) с зарубежными штаммами ADV-G, ADV-SL3, ADV-TR, ADV-PUL.

Рис. 2. ДНК гипервариабельного участка вируса АБН.

Как видно из рисунка, анализируемый участок генома сильно варьирует в зависимости от штамма. Обращают на себя многочисленные нуклеотидные замены делающие невозможным подбор праймеров в этой области, позволяющих достоверно обнаруживать любой из известных к настоящему времени вариантов вируса.

Поскольку нашей задачей был подбор праймеров, которые позволяют диагностировать любой вирус АБН, мы не рассматривали гипервариабельную область, исключив ее из дальнейшего анализа.

Используя программы Primer, Primer_premier5, Vector NTI Suite 9 мы получили набор нуклеотидных праймеров, из которых наше внимание привлекла одна пара, наиболее подходящая по нашему мнению для решения стоявшей задачи. Далее мы приводим ее параметры.

Пара праймеров, позволяет амплифицировать продукт с длиной в 201 нуклеотид (рейтинг – 171). Регион для амплификации от 638 до 838 нуклеотида. Температура денатурации 70,2°С, оптимальная температура отжига в реакции с использованием данной пары 46,5 °С, что связано с процентным содержанием гуанин-цитозина (G-C составом) равном 33,3.

Прямой праймер имел следующую первичную структуру:

5´ TCCTTAGGTTGGTTTATGAA 3´

Однородность: 100,0 %

Длинна: 20 нуклеотидов Tm: 44,2 °С GC: 35,0

dH: 150,5 kcal/mol dS: -397,3 cal/mol dG: -30,3 kcal/mol

Обратный праймер:

5´ TCTCAAGTGAACTGGTTTAT 3´

Однородность: 100,0 %

Длинна: 20 нуклеотидов Tm: 40,9 °С GC: 35,0

dH: 139,1 kcal/mol dS: -367,7 cal/mol dG: -27,7 kcal/mol

Разница Tm: 3,3

Разница GC: 0,0

Опыты по амплификации, поставленные с четырьмя клиническими изолятами вируса АБН, показали высокую эффективность использования данных праймеров для обнаружения различных вариантов возбудителя.

_{На этом первый этап нашей работы заканчивается и следующим этапом идет разработка дискриминирующих тестов, которые позволили бы узнать, какой именно штамм вируса был нами диагностирован (обнаружен).}

УДК 619:615.281

Сеземин И.А., Лосев М.Б.

Научный руководитель − профессор Павлов Г.В.