Определение жизнеспособности яиц или личинок по внешнему виду

Яйца гельминтов микроскопируют в начале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по их гибели зернистость распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли – так называемые нитки жемчуга.

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37⁰С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от места их нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле – разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина 0,5 г, натрия бикарбоната 0,09 г, дистиллированной воды 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36-38⁰С на 4 часа. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6-8 часов в термостате при 38⁰С.

Если поместить яйца тениид в 1% раствор натрия сульфида, или 20% раствор натрия гипохлорита, или же в 1% раствор хлорной воды при 36-38⁰С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 суток. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем «растворяются» в течение 10мин – 2 час. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1% раствора натрия хлорида, 0,5% раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36-38⁰С. Жизнеспособность сколексов эхинококков определяют при слабом нагревании. Для этого отмытые в воде сколексы или выводковые капсулы помещают в каплю воды на предметное стекло с луночкой, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом с нагревательным столиком при температуре 38-39⁰С. Если отсутствует нагревательный столик, препарат подогревают при помощи любого источника тепла. При этом жизнеспособные сколексы активно двигаются, сокращая или расслабляя присоски, удлиняя и укорачивая хоботок. Если поместить сколексы в 0,5-1% водный раствор филицилена при комнатной температуре, то все жизнеспособные сколексы быстро вывернутся и погибнут. Нежизнеспособные сколексы при этом не вывертываются.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Жизнеспособность яиц карликового цепня определяют по расположению крючьев на зародыше.

В живых яйцах карликового цепня происходят вялые маятникообразные движения протоплазмы и почти незаметные раздвигания и сдвигания заостренных концов латеральной пары крючьев в стороны от средней пары. Сокращения протоплазмы зародыша и зародышевых крючьев помогают зародышу освободиться от оболочек онкосферы, а затем и от наружной оболочки яйца.

В живом яйце медианная пара и боковые пары крючьев расположены параллельно, в некоторых яйцах лезвия боковых пар сближены и расположены по отношению к средней паре крючьев под углом 45⁰.

Погибающий зародыш конвульсивно сокращается и вяло раздвигает крючья. В погибшем зародыше движение крючьев прекращается, и они располагаются в беспорядке, иногда же латеральные по отношению к соседней паре крючья бывают раздвинуты по прямым, тупым или острым углом.

Иногда наблюдается сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5-10 до 38-40⁰С.

Определение жизнеспособности незрелых нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3% раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24-30⁰С, яйца власоглавов в 3% раствор соляной кислоты при температуре 30-35⁰С, яйца остриц в изотонический раствор натрия хлорида при температуре 37⁰С. Чашки Петри следует открывать 1-3 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2-3 мес. свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых суток развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию – морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, осторожно наливают на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1-2 суточного отстаивания в темноте при температуре 25-30⁰С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5-7 суток они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны невооруженным глазом. Естественно развивающиеся в воде яйца трематод, например описторхов, дифиллоботриид, фасциол и др., помещают на часовое стекло, чашку Петри или другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они быстрее развиваются в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22-24⁰С через 9-12 сут. формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету. При культивировании воду меняют через 2-3 суток.

Личинки анкилостомид и стронгилоид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После нахождения в термостате при температуре 26-30⁰С в течение 5-6 суток личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий (метод Фюллеборна).

Метод Harada и Mori (1955). В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальной бумаге (15×150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Верхний конец накрывают куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер и фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят в течение 8-10 сут. при температуре 28⁰С. Для изучения культуры снимают и удаляют целлофановую покрышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50⁰С на 15 мин, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными, представленными в таблице 12.

Таблица 12.

Дифференциальная диагностика филяриевидных личинок