1.3 Молекулярные маркеры в генетических исследованиях и селекции

Еще в первые десятилетия развития генетики стало ясно, что генетические маркеры могут быть полезными при анализе сложных признаков. Однако низкая встречаемость и ряд других недостатков не позволили классическим генетическим маркерам, а впоследствии и белковым маркерам широко войти в селекционную практику. Последнее поколение генетических маркеров (молекулярные, или ДНК-маркеры) характеризуется более высокой частотой встречаемости в геноме и основано на универсальных, а значит широко востребованных и постоянно развивающихся методах анализа. Это стало залогом бурного развития направлений генетики и селекции, связанных с использованием ДНК-маркеров.

Роль молекулярных маркеров в современной генетике трудно переоценить. С их помощью составлены подробные молекулярные карты генома человека и десятков видов растений и животных, на которые нанесены важнейшие гены, определяющие рост и развитие организмов, морфологические признаки, устойчивость к заболеваниям и другие свойства. Молекулярные маркеры широко используются в популяционной генетике, сравнительной генетике и геномике, в филогенетических исследованиях. Благодаря молекулярным маркерам расширяются возможности медицинской диагностики, появляются новые более точные методы паспортизации пород животных и сортов растений. Использование молекулярных маркеров позволяет значительно ускорять процесс селекции [Алтухов и др., 2002; Банникова, 2004; Сулимова, 2004; Смарагдов, 2009; Матвеева и др., 2011; Хлесткина, 2011].

Приступая к данному разделу обзора, необходимо уточнить широко употребляемые здесь термины «селекция» и «отбор». По Н.И. Вавилову (1938) селекционная наука как целая объединяет в себе 5 основных разделов, названных им: учением об исходном материале, учением об изменчивости, теорией гибридизации, теорией селекционного процесса (отбора) и теорией селекции по специальным признакам [Вавилов, 1967]. В число специальных признаков включена, в частности, устойчивость к болезням. С этих позиций теория отбора - только часть селекции, хотя и чрезвычайно важная.

Специалисты в области молекулярно-генетических технологий (особенно англоязычные) часто редуцируют понятие селекции, используя соответствующий термин как синоним отбора. Точка приложения и, как следствие, роль молекулярно-генетических методов в селекции теряют свою определённость.

Молекулярные маркеры (синоним - ДНК-маркеры) - это генетические маркеры, анализируемые на уровне ДНК. ДНК-маркеры являются третьим поколением генетических маркеров. Им предшествовали белковые маркеры, а еще ранее - классические морфологические генетические маркеры. Впервые теоретическое обоснование использованию генетических маркеров («сигналей») дал около века назад А.С. Серебровский: «… сигналями мы называем удобные для менделистических наблюдений альтернативные гены с более или менее известной локализацией, которые, не оказывая воздействия на изучаемый трансгрессирующий признак и влияя достаточно определенным образом, облегчают генетический анализ этого признака, позволяя следить за наследованием того участка хромосомы, в котором эти сигнали расположены» [Серебровский, 1970].

В настоящее время насчитывается несколько десятков типов молекулярных маркеров. Наиболее широко используемыми ДНК-маркеры являются:

· AFLP (amplified fragment length polymorphism) - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов.

· CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) - расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности.

· DArT (diversity array technology) - ДНК-чип технология для изучения разнообразия.

· IRAP (inter-retrotransposon amplified polуmorphism) - полиморфизм амплифицированных последовательностей между ретротранспозонами.

· ISSR (inter simple sequence repeats) - межмикросателлитные последовательности.

· RAPD (random amplified polymorphic DNA) - случайно амплифицированная полиморфная ДНК.

· RFLP (restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.

· SCAR (sequence characterized amplified region) - амплифицированная область, охарактеризованная нуклеотидной последовательностью.

· SNP (single-nucleotide polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм.

· SSAP (sequence-specific amplification polymorphism) - полиморфизм сиквенс-специфичной амплификации.

· SSCP (single strand conformation polуmorphism) - полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК.

· SSR (simple sequence repeats) - простые повторяющиеся последовательности (микросателлиты).

· STS (sequence tagged site) - сайт/локус, маркированный нуклеотидной последовательностью.

Их разделяют на три группы, согласно основному методу анализа: маркеры, исследуемые с помощью блот-гибридизации, ПЦР и ДНК-чипов. Данная классификация отражает процесс «эволюции» ДНК-маркеров. Первая из трех перечисленных выше групп представляет собой первое поколение ДНК-маркеров, получивших широкое распространение в 1980-е годы. В 1990-е годы ключевые позиции заняли ПЦР-маркеры, в 2000-е годы их существенно потеснили молекулярные маркеры, основанные на использовании ДНК-чипов. В последние 2-3 года для анализа полиморфизма ДНК все чаще используют метод прямого секвенирования генома или его отдельных участков.

К молекулярным маркерам наравне с классическими генетическими применяют термины «локус», «аллель», «доминантный», «кодоминантный». Молекулярные маркеры подразделяют на монолокусные и мультилокусные. Монолокусные маркеры наследуются чаще всего по кодоминантному типу, мультилокусные - по доминантному.

Таблица 1. Классификация молекулярных маркеров

Среди молекулярных маркеров различают маркеры с известной локализацией (в определенной хромосоме или участке хромосомы, или вблизи конкретного гена) и маркеры, о локализации которых ничего не известно (как правило, это мультилокусные маркеры). Как те, так и другие находят свое применение в генетических исследованиях и в селекции. Молекулярные маркеры с неизвестной локализацией нельзя использовать для маркирования определенного гена или хромосомы, зато их успешно применяют в филогенетических исследованиях, для паспортизации сортов растений и пород животных. Некоторые мультилокусные маркеры подходят для создания генетических карт (DArT- и AFLP-маркеры), а также для геномной селекции (DArT)). На выбор ДНК-маркеров подходящего типа для решения конкретной задачи влияют и такие характеристики, как уровень внутривидового полиморфизма и возможность автоматизации процесса анализа полиморфизма ДНК (рисунок 1).

С внедрением ДНК-маркеров наибольший размах приобрели среди прочих такие направления, как построение молекулярных карт отдельных хромосом и геномов, картирование на них генов и локусов количественных признаков (QTL). В 1980 г. Дэвид Ботштейн совместно с Р. Уайтом, М. Школьником и Р. Дэвисом разработал первые монолокусные генетические маркеры на основе анализа полиморфизма ДНК (а именно полиморфизма длины рестрикционных фрагментов - RFLP) и показал, что с их помощью можно проводить построение генетических карт [Botstein et al., 1980].

За этой пионерской работой последовало создание RFLP-карт различных видов животных и растений. Насколько эффективно RFLP-маркеры позволили продвинуться в картировании геномов, иллюстрирует следующий пример. Первая RFLP-карта генома пшеницы [Liu, Tsunewaki, 1991] содержала в 1,5 раза больше локусов и была в 1,2 раза длиннее прежней классической генетической карты, ставшей результатом трудов многих исследователей в течение нескольких десятилетий.

Рис. 1 - Уровень внутривидового полиморфизма и возможность автоматизации анализа различных типов ДНК-маркеров [Хлесткина, 2011]

Выяснилось, что RFLP-маркеры, разработанные для одного вида, могут использоваться для анализа геномов родственных видов и родов. Таким образом, стало возможным сравнительное картирование геномов, благодаря которому внутри отдельных семейств удалось выявить ряды ортологичных генов и проследить преобразования структуры генома отдельных видов в ходе эволюции от общего предка. Результаты этих работ крайне важны для современных исследований в области сравнительной геномики [Moore et al., 1995].

Благодаря использованию RFLP-карт появилась возможность определять точное положение отдельных генов в геноме и клонировать их последовательности на основе картирования (map-based gene cloning- позиционное клонирование генов). Пионером в области позиционного клонирования генов является американский исследователь Стивен Тэнксли. Под его руководством при использовании данного метода был впервые клонирован ген устойчивости к бактериальной пятнистости плодов томата [Martin et al alal., 1993]. С. Тэнксли был первым и среди тех, кто оценил потенциальные преимущества отбора по генотипу и в 1983 г. одновременно с Жаком Бекманом предложил использовать ДНК-маркеры в селекции [Beckmann, Soller, 1983; Burr et al al., 1983; Tanksley, 1983].

Анализ проявления того или иного признака осуществляется на строго определенной стадии развития. Образцы для генотипирования можно отобрать практически в любой удобный момент. Отбор проб для выделения необходимого количества ДНК на ранних стадиях развития селектируемых организмов позволяет своевременно изымать из селекционного процесса значительное количество материала, не потратив на анализ и уход за ним лишних средств.

На результаты фенотипирования влияют различные факторы окружающей среды. Генотип не зависит от изменения условий среды. Если отбор ведется на основании анализа фенотипа, то при полном доминировании невозможно отличить доминантные гомозиготы от гетерозигот и, следовательно, выбрать индивидуумы для скрещивания в текущем поколении. С помощью ДНК-маркеров легко справиться с этой задачей.

Методы селекции, в которых применяются ДНК-маркеры, разделяют на две основные группы:

1). ОПМ - отбор с помощью маркеров (MAS -marker-assisted selection); синонимы: МАС (маркер-ассоциированная селекция) и МОС (маркер-опосредованная/ориентированная селекция). Подход в современной селекции растений и животных, позволяющий проводить отбор по генотипу при использовании ДНК-маркеров, тесно сцепленных с селектируемым геном.

2). Геномная селекция (genomic selection). Метод современной селекции растений и животных, позволяющий при использовании равномерно распределенных по геному ДНК-маркеров проводить отбор по генотипу в отсутствие данных о генах, влияющих на признак.

Метод ОПМ предполагает использование ДНК-маркеров, тесно сцепленных с целевым геном, вместо или вместе с фенотипическим анализом. Маркеры, тесно сцепленные с целевым геном, являются надежным инструментом для предсказания фенотипа. Отбор нужного аллеля целевого гена осуществляется на основе тесно сцепленного с ним аллеля соседнего маркерного локуса. Бульшая точность отбора достигается при использовании пары маркеров, расположенных вблизи гена по разные стороны от него (т. е. маркеров, фланкирующих целевой ген). Если ген отсеквенирован и выявлены различия нуклеотидной последовательности разных аллелей данного гена, то можно разработать так называемый «внутригенный маркер». Использование такого маркера позволит отбирать нужные генотипы с наиболее высокой точностью.

Метод ОПМ хорошо зарекомендовал себя при беккросной и линейной селекции, а также при создании пирамид генов [Moose, Mumm, 2008].

При беккросной селекции можно вести отбор по внутригенному маркеру (foreground selection), по маркерам, тесно сцепленным с геном (recombinant selection), по генетическому фону (background selection), а также комбинировать отбор по генетическому фону с отбором по внутригенному маркеру или по маркерам, тесно сцепленным с геном. Использование значительно большего числа маркеров, равномерно распределенных по геному, позволяет не только контролировать передачу целевого гена от донора реципиенту, но и ускорять восстановление генома реципиента.